Terapia epigenómica en la fibrosis quística

Tema: Los inhibidores de HDAC rescatan múltiples variantes de CFTR que causan enfermedades
Mecanismo epigenómico tratado: Acetilación y desacetilación de histonas

Cómo se lo hizo:  Mediante inhibidores de las histonas desacetilasas (HDACi). Se examinó el impacto del belinostat HDACi (PXD-101), panobinostat (LBH-589) y romidepsina (FK-228) sobre la estabilidad, el tráfico y la función de las variantes CFTR solas o en combinación con el corrector CFTR, Vx809.

Resultados: El panobinostat (LBH-589) y la romidepsina (FK-228) proporcionan una corrección funcional de las variantes de CFTR de clase II y III, restaurando la actividad del canal de cloruro de la superficie celular en las células epiteliales bronquiales humanas primarias. Además, se demostró un efecto sinérgico de estos HDACi con Vx809, que puede restaurar significativamente la actividad del canal para múltiples variantes de CFTR. Estos datos sugieren que HDACi puede servir para nivelar el campo de juego celular para corregir las mutaciones que causan la FQ. 

Información obtenida de:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30753450/

 Técnica de edición de ácidos nucleicos en la fibrosis quística

Edición de p.F508del en células de pacientes con fibrosis quística

- Tipo de edición: Ex vivo, somática

- Dirigido hacia: ADN genómico - Mutación ΔF508 del gen CFTR

- Dirigido por: 

CRISPR/Cas9, nucleasas SpCas 9; sgRNA y ssODN (oligodesoxinucleótido monocatenario)

   Uso de vector: plásmido pGEM-CFTR

- Órgano/célula a tratar: Células CFTE29o- (Línea celular epitelial traqueal de fibrosis quística humana) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes con fibrosis quística (FQ)

- Vía de administración: Vía parenteral

- Resultados 

Corto plazo: SpCas9 (HF4) -sp_sg # 1 junto con sp_ssODN # 1 fueron las combinaciones más precisas y efectivas en el locus genómico: la mutación p.F508del se corrigió con precisión en casi el 50% de las roturas de doble hebra de ADN inducidas por Cas9.

Tras evaluar las inserciones de CTT en el gen CFTR (corrección de la mutación p.F508del). A diferencia de los experimentos con células CFTE29o-, en las iPSC casi todas las combinaciones CRISPR / Cas9 utilizadas fueron precisas. Sin embargo, la combinación SpCas9 -sp_sg # 2 con sp_ssODN # 2 condujo a una HDR imperfecta en todos los casos en el locus del plásmido.

Mediano plazo: Los resultados demuestran que aunque CRISPR/Cas9 se puede utilizar para corregir células individuales en el cultivo, todavía queda un largo camino por recorrer para lograr resultados clínicamente significativos.

Largo plazo: Se espera que esta CRISPR/Cas9 corrija permanentemente la expresión fisiológica de la mutación ΔF508, para poder aplicarla en otras mutaciones del gen CFTR. 

Información Obtenida de:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33175893/

Terapia con Stem Cells en Fibrosis Quística 

- Tipo de Stem Cells: iPSC (Células madre pluripotenciales inducidas)

- Método de obtención: Obtención de fibroblastos de un paciente con FQ por medio de biopsia transbronquial; para conseguir iPSC de los fibroblastos mediante reprogramación celular, con el cóctel clásico de cuatro componentes que consta de: Oct3/4, Sox2, Klf4, C-Myc. 

Posteriormente, corrección de la mutación de CFTR, ya sea con CRISPR/Cas9 o nucleasas de dedos de zinc (ZFN); hacer crecer un número ilimitado de iPSC corregidas; e inducir a las iPSC a diferenciarse; y desplegarlos nuevamente en el paciente con FQ que donó el fibroblasto original como medicina personalizada. 

- Vía de administración: Vía parenteral - intravenosa 

- Resultados

Corto plazo: Visión innovadora sobre las iPSC, adicionalmente, no tienen implicaciones éticas. 

Mediano plazo: Reducción de la hipoxemia, aumentando la función pulmonar. 

Largo plazo: Disponer de modelos celulares de respuesta a fármacos, con el fin de lograr una terapia efectiva para la FQ. 

Información obtenida de:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30062693/
https://www.tdx.cat/handle/10803/572066#page=12

Ejemplo de transgénico animal o vegetal para la fibrosis quística

Tema: Un modelo de oveja de fibrosis quística generado por la disrupción CRISPR/Cas9 del gen CFTR
Tipo de animal transgénico: Oveja KO (Knockout), que no presenta el gen CFTR
Método por el que fue obtenido: - Transferencia nuclear - Técnicas de edición del genoma CRISPR/Cas9
Usos: Simulación de enfermedades humanas (fibrosis quística), para avanzar con el desarrollo de nuevas terapias para la FQ

Información obtenida de: 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6237476/

Ventajas y desventajas de los transgénicos

Ventajas	Desventajas
Producción de biofármacos	Costos elevados en la producción, que no están al alcance de muchos
Obtención de xenotransplantes	Algunos xenotransplantes de órganos pueden provocar reacciones tóxicas en los humanos
Estudiar algunos aspectos importantes de determinadas enfermedades humanas (resistencia, tratamiento y prevención)	Posible pérdida de la biodiversidad, además de la alteración de especies y ecosistemas
Encontrar nuevas terapias para enfermedades crónicas	Al modificar virus, podrían generar enfermedades nuevas
Producción animal: mejoras en la sanidad y bienestar animal, mejoras de productos de origen animal o vegetal	Algunos alimentos transgénicos pueden tener impactos perjudiciales para la salud

Información obtenida de: 

http://revista-academica.utb.edu.ec/index.php/pertacade/article/view/174

https://www.biomed.cas.cz/physiolres/pdf/2019/68_525.pdf

ADN Recombinante artificial para fibrosis quística

Tema: Adaptación de Pseudomonas aeruginosa a la infección crónica en fibrosis quística: identificación de cepas con peptidoglicano de reducida capacidad inflamatoria y/o resistencia a la lisozima
Objetivo: Encontrar dianas relacionadas con el peptidoglicano (PGN) de Pseudomonas aeruginosa hasta el momento ignoradas, para el futuro diseño de soluciones terapéuticas destinadas a combatir las infecciones nosocomiales o, hacerlas menos dañinas para el paciente.
Gen: Gen acsA: 4.8Kb
Enzimas de restricción: No se especifica
Enzima ligasa: ADN ligasa T4
Vector: Fago (fQSE) 
Célula receptora: Célula procariota. Pseudomona aureginosa A549
Mecanismo de transferencia del gen: Transformación por shock térmico
Métodos de identificación de clones: Método Microbiológico - Cultivo. Método molecular - Técnica de secuenciación de múltiples alelos (MLST). Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE)

Información obtenida de:

https://dspace.uib.es/xmlui/bitstream/handle/11201/146244/tfm_2015-16_MMAV_ycv529_438.pdf?sequence=1&isAllowed=y

https://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi?accid=PMC7082326&blobtype=pdf

Ejemplo de Recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza 

Recombinación V(D)J

Las regiones variables de las cadenas de receptores de antígeno están determinadas por distintas combinaciones génicas de los segmentos V (variable), D (diversidad) y J (joining). Los segmentos V, D y J se reordenan a nivel génico durante el desarrollo de los linfocitos mediante un proceso denominado recombinación V(D)J. Este proceso permite la generación de un enorme repertorio de receptores para antígenos distintos en linfocitos T y B con una mínima inversión en material genético. Este proceso confiere una especificidad antigénica distinta a cada linfocito, lo que permite un reconocimiento ilimitado de antígenos distintos.

Información obtenida de: 

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31511698/

 Una técnica de secuenciación para la fibrosis quística

Mediante la secuenciación masiva del gen CFTR, se analizó toda la secuencia codificante y los bordes exón-intrón del gen CFTR buscando mutaciones. El resultado de las secuencias obtenidas para cada individuo fueron comparadas con la secuencia consenso de CFTR mediante software, todas las variantes detectadas se confirmaron con secuenciación por el método de Sanger y se contrastaron con los datos alojadas en las principales bases de datos de fibrosis quística. 

La secuenciación tiene limitaciones ya que no permite detectar rearreglos, como deleciones y duplicaciones del gen CFTR que también son causa de enfermedad, para ello será necesario analizar con técnicas complementarias. 

Información obtenida de: 

https://genotipia.com/wp-content/uploads/2019/04/GMG3-67-73-Armas-web.pdf

 Una prueba PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la fibrosis quística

En este caso se obtuvo ADN genómico a partir de sangre y el mismo se amplificó por PCR con cebadores específicos para el exón 10, el producto de amplificación se incubó con la enzima de restricción Mbol a 37°C. Para amplificar el exón 10 del CFTR se utilizó un cebador 5’ que introduce parte de la secuencia del sitio de corte para la enzima Mbol; ésta es completada en el alelo sano por el triplete CTT, pero no en el alelo afectado. El cebador 3’ se eligió para contar con un control interno de actividad enzimática. Finalmente se detectó la mutación F508del en la mayoría de pacientes. 

Información obtenida de: 

http://www.scielo.org.pe/pdf/rins/v34n1/a09v34n1.pdf

 Alteraciones de la Epigenómica en la fibrosis quística

La herencia es un factor clave en la fibrosis quística, pues esta enfermedad se transmite de padres a hijos de forma autosómica recesiva, ya que se desarrolla cuando los dos alelos procedentes, uno de cada progenitor, no son funcionales, es decir, presentan mutaciones en el gen CFTR. Por otro lado, esta enfermedad genética, es más frecuente en la población caucásica, de tez blanca y con ancestros españoles, no se ha reportado incidencia según el sexo. 

Información obtenida de: 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1695403318305393?via%3Dihub
http://revgenetica.sld.cu/index.php/gen/article/view/69/108

 Alteración de la traducción en la fibrosis quística

El gen CFTR codifica una proteína de 1480 aminoácidos denominada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), con un peso molecular de aproximadamente 170kDa. La mutación más frecuente es la deleción de tres pares de bases en el exón 10 del gen, que provoca la pérdida del aminoácido fenilalanina, ubicado en la posición 508 de la proteína, alteración conocida como F508del. 

Información obtenida de:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7147672/